Primer 짜는 방법 (NCBI)

 

NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 우리에게 필요한 Primer를 짜는 방법에 대해서 간단히 정리해보려 합니다.

 

 

우선, NCBI에 접속을 합니다. 주소는 아래와 같습니다.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

National Center for Biotechnology Information

 

 

그럼, 아래와 같은 화면이 나옵니다. 저는 mRNA를 활용한 실험에 필요한 Primer를 짤 계획이기 때문에, 오른쪽의 항목들 중 'Nucleotide'를 선택하여 들어갔습니다.

 

 

그리고 검색창에 Primer를 짜고 싶은 대상을 검색해줍니다. 저의 경우에는, 사람에게 나타나는 gene을 대상으로 만들 계획이기 때문에 'Homo sapiens'라고 치고, 그 뒤에 gene의 이름을 쳐서 검색하였습니다. (사람 + gene name)

 

 

그럼, 아래와 같은 검색 결과창이 나오게 됩니다.

 

 

그리고 그 아래에 해당 이름의 여러가지 버전 항목이 나열되어 있습니다. 이 중, 목적에 알맞은 항목을 선택해야 합니다. 저의 경우에는 mRNA를 분석할 계획이기 때문에 맨 뒤에 'mRNA'라고 적혀져있는 것들을 선택하였습니다. 간혹 'varient 1/2/3...'와 같이 여러 개가 있는 경우도 있는데, 하나만 선택하여도 되고, 모두 선택하여도 됩니다. (이것 또한 목적이나 필요 정도에 따라 다를 수 있습니다.)

 

 

원하는 목록을 눌러주면 아래와 같은 페이지로 넘어가게 됩니다.

 

 

저의 경우에는, 아래로 내려가다보면 'CDS'라는 것이 나오는데, 이것을 클릭해주었습니다.

 

 

그럼 아래와 같은 정보들이 뜨고, 오른쪽 아래에 있는 'FASTA'를 클릭해줍니다.

 

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그럼, 다음과 같은 정보가 나오게 됩니다. 나중에 우리가 짠 Primer와 관련해서 다시 찾아볼 수 있도록 해당 정보를 복사해서 따로 저장해 둡니다.

 

 

그런 후, 오른쪽에 있는 'Pick Primers'를 클릭해줍니다.

 

 

그럼, 최종적으로 아래와 같은 설정 화면이 나옵니다. 본인의 설계에 맞는 조건을 맞춰주면 됩니다.

• 1번의 경우에는, 원하는 mRNA 정보가 들어있습니다. 만약, 동시에 다수의 mRNA를 대상으로 분석해야 한다면, 저 칸 안에 원하는 mRNA accession 정보를 여러개 넣어주면 됩니다.
• 2번의 경우에는, 1개의 mRNA일 때에는 자동으로 정보가 기입이 됩니다. 만약 여러개의 mRNA의 분석이 필요한 경우에는 보통 빈칸으로 두는 것으로 보입니다.
• 3번은 PCR 형성 길이의 범위를 뜻합니다. 사람마다 그리고 실험마다 다르겠지만, 저의 경우에는 최대 길이 200으로 설정했습니다.
• 4번은 온도인데, 보통 60도 안밖으로 하는 것 같습니다.
• 5번은 Primer에 exon-exon junction 포함 여부 설정입니다. 가능하면 포함시키는 것으로 설정하고, 너무 길거나 다양한 mRNA 분석 시에는 설정 안하는 경우도 있는 것 같습니다.

 

 

분석 과정이 조금 오래 걸릴수도 있습니다. 조금 기다리다보면 다음과 같은 결과를 보여줍니다. 이 경우에는 총 10개의 primer 후보군이 나왔습니다.

 

 

그 아래에는 이처럼 각 primer의 자세한 정보들을 보여줍니다. 일반적으로 Tm은 온도로서 60도에 가까우면 좋습니다. 그리고 Forward와 Backward 간의 온도 차이가 적으면 적을수록 좋습니다. 그리고 Self 3’ complementarity은 낮으면 낮을수록 좋다고 합니다. GC%은 일반적으로 50-60면 좋다고는 하지만 크게 신경쓰지 않아도 좋을 것 같습니다. Self complementarity는 자기 상보성을 나타내주는 것으로 5 이하면 괜찮다고 합니다. 그리고 낮으면 낮을수록 좋습니다. 이와 같은 수치들을 비교해보고 실험에 가장 알맞는 Primer를 선택하면 좋을 것 같습니다.