PCR (polymerase chain reaction)

 

PCR은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)이라고 하는 것으로, DNA와 같은 유전 물질의 원하는 부분을 복제 및 증폭시키는 분자생물학적인 기술입니다. 이 기술은 염기순서가 동일한 소량의 유전물질을 많은 양으로 증폭시킬 수 있으며, 이를 유전물질 존재 여부의 파악을 통해 유전 질환을 진단하거나 감염질환의 진단에도 활용이 가능합니다. 다시 말해, 매우 복잡하고 양이 적은 DNA 용액에서 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있습니다. 증폭에 사용되는 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순한 장점을 가지고 있습니다.

 

 

초기에는 대장균의 DNA 중합효소 I(DNA polymerase I)의 클레나우 절편을 이용해 중합효소의 연쇄 반응을 유도하는 방법을 사용했습니다. 그러나 클레나우 절편이 열에 약해 반응온도를 37°C로 제한할 수 밖에 없었고 연쇄 반응을 위해 주기마다 효소를 새로 넣어 주어야 했습니다. 그리고 생성물의 최대 길이도 400bp까지인 한계가 있었습니다. 이후 1988년에 DNA 중합효소로 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)의 DNA 중합효소인 Taq 중합효소를 사용한 논문이 발행되면서 열에 강한 이 중합효소는 PCR의 효율을 월등히 끌어올렸습니다.

 

 

우선, PCR 과정에서 필요한 것들은 아래와 같습니다.

• 복제할 대상의 DNA
• 프라이머: DNA 복제가 시작되는 지점 제공
• DNA 뉴클레오타이드: DNA 구성 물질
• DNA 중합효소(Taq): 중합효소 연쇄 반응이 일어나는 과정에서 가열과 냉각의 반복으로 열에 변성이 일어나지 않아야 함
• DNA 중합효소용 완충용액: 효소가 활성을 얻는 데 필요한 것들 포함
• dNTP: DNA 합성 될때 필요한 재료 (3개의 인산이 결합된 디옥시리보뉴클레오타이드 - 합성에 필요한 4가지 염기의 뉴클레오 타이드를 모두 제공해야 되어야 함으로 dATP, dTTP, dGTP, dCTP 모두 필요)

 

 

PCR 과정을 아래와 같습니다.

 

1) DNA 변성 (Denaturation)

 

첫번째 과정은  DNA 변성입니다. 이 과정에서는 두 가닥으로 구성된 DNA에 열을 가하여 각각의 단일 가닥으로 분리시킵니다. 보통 92~95°C로 가열하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리시키고, 각각의 DNA 가닥이 주형(Template)로 수행을 할 수 있게 합니다. 높은 온도일수록 이중가닥의 DNA가 단일가닥으로 잘 이행되지만, 지나치게 높은 상황에서는 Taq DNA 중합효소가 변성이 되어 사용할 수 없게 될 수 있어 보통 94°C로 합니다. DNA 내 결합 중 G-C는 삼중결합을 하고, A-T는 이중결합을 이루기 때문에 G-C의 양이 많을수록 결합력이 강합니다. 그렇기 때문에 DNA 내 G-C의 양과 DNA의 길이에 따라 변성 온도는 달라집니다.

 

 

2) 프라이머 결합 (Annealing)

 

두번째 과정은 프라이머(Primer) 결합입니다. 이 단계에서는 프라이머가 주형 DNA에 결합을 하게 되고, 최적의 온도를 위해 보통 50°C ~ 65°C에서 진행이 됩니다. 프라이머가 자신의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 DNA에 결합하는 과정입니다. 이때, 염기간의 결합 중 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G-C 결합이 A-T결합보다 강합니다. 따라서 G-C 비율에 따라 결합온도 에 변화를 주는 것이 좋습니다. 일반적으로 G-C content 가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직하다고 합니다. 보통 30초가량 지속되는 이 단계에서 5'→3'방향으로 DNA의 합성이 시작됩니다. 결합 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소인데, 온도가 너무 높으면 프라이머가 주형 DNA에 너무 약하게 결합하여 증폭된 DNA 산물이 적어지고, 온도가 너무 낮으면 프라이머가 비특이적 결합을 해 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있습니다.

 

 

3) DNA 신장 (Elongation)

 

PCR의 세 번째 단계는 신장 단계 입니다. 이 단계에서는 열에 강한 DNA 중합효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만들게 됩니다. 보통 70°C ~ 74°C에서 시행하며, 원하는 PCR산물의 크기가 크거나 반응효소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수도 있습니다. Taq 중합효소는 보통 1분에 2,000-4,000 염기쌍을 중합할 수 있으므 로 원하는 PCR산물의 크기 1kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어나게 됩니다. (마지막 cycle에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주어서 효소의 활성이 충분히 발휘되도록 하는 것이 좋다고 합니다.)

 

 

일련의 세 개의 단계가 있고 이 과정들을 30~40회 정도 반복하여 DNA의 언하는 부분을 증폭시키게 됩니다. 아래의 그림은 PCR 과정을 나타낸 것 입니다.

PCR 과정

 

 

PCR 방법은 현재 생물학에서 쓰이지 않는 곳이 없다고 볼 수 있으며, 근래 과학 수사나 친자 감별 등에 자주 이용되는 DNA 지문 분석(DNA fingerprinting) 역시 PCR 법을 이용해서 이루어집니다. 생물학에서는 여러 유전병을 판별하기 위해서 인간 유전학에서 사용하는 경우가 있으며, 오래된 고생물이나 멸종 생물의 희소 DNA를 증폭하기 위해서도 이용됩니다. 분류학에서도 종 간의 DNA 비교를 위해 PCR 법을 널리 이용하고 있으며, 분자생물학에서는 DNA나 RNA를 다루기 위해서 반드시 이용되는 매우 중요한 기술로 받아들여지고 있습니다.

 

 

대표적인 이용 분야는 다음과 같습니다.

• 선택적 유전자 증폭: DNA 특정 부분 증폭을 통한 DNA조각 분리 가능, 조그만 부분을 통해 대량의 순수한 DNA조각들을 얻을 수 있어 혼성화 탐침(hybridization probe)방법과 DNA 클로닝 등에 이용
• DNA 증폭 및 정량화: 타겟 서열의 증폭을 통해 극미량의 샘플만으로도 그 DNA의 서열을 알아낼 수 있음, 아주 오래된 DNA에도 사용 가능(고대 매머드 유전자 분석 등), 특정 DNA 서열의 양을 추정 가능(주로 유전자 발현의 정도 측정에 이용)
• 질병 진단: 백혈병이나 림프종의 진단에 활용, 특정 악성 세포의 위치를 정확히 측정 가능

 

 

PCR은 DNA, RNA수준의 PCR로 나뉠 수 있습니다. 보통 유전자를 얻는 실험을 할 경우, 그 유전자의 전체를 보려는 것보단 유전자 안에서의 특정 유전자를 관찰하는 것이 목적인 경우가 많습니다. 하지만 DNA를 바로 PCR하게 되면 특정 유전자를 얻기 힘들고 진핵 생물의 경우, 인트론(Intron; 비발현부위)이 같이 나오는 등 여러 가지 문제점이 있습니다. 그것을 해결하기 위해 특정 유전자에 프라이머를 붙인 다음, PCR을 DNA수준이 아닌 RNA수준에서 하는 역전사-PCR(RT(Reverse Transcriptase)-PCR)이 있습니다. 요즘에는 반응의 결과를 극대화하기 위해 Taq 중합효소 뿐만 아니라 여러 회사들에서 독자적으로 개발한 복합효소를 사용하기도 합니다.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

[Source]

- Principles of medical biochemistry 4th edition, Gerhard Meisenberg, William H. Simmons

-  https://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%A4%91%ED%95%A9%ED%9A%A8%EC%86%8C_%EC%97%B0%EC%87%84_%EB%B0%98%EC%9D%91

- https://local.koreasci.com/download/manual/Edvotek/EDS48.pdf