역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR, Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

역전사 중합효소 연쇄 반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)은 RNA를 DNA로 전환한 후, 그 DNA를 증폭하는 기술입니다. RNA는 구조적으로 매우 불안정하기 때문에, RNA 자체를 증폭시키면, 변이가 많이 발생하게 되기 때문에, cDNA를 통한 증폭 기술을 활용합니다. 이 방법은 RNA 바이러스의 검출, 유전자 발현 분석, cDNA 합성 등에 사용됩니다. RT-PCR은 크게 다음의 두 단계로 이루어집니다.

 

 

1. 역전사(Reverse Transcription)

이 단계에서는 RNA를 DNA로 변환합니다. 이를 위해 역전사 효소(Reverse Transcriptase)가 필요합니다. 역전사 효소는 RNA 서열을 상보적인 DNA(cDNA) 서열로 변환합니다. 과정은 다음과 같습니다:

• RNA 추출: 샘플에서 RNA를 추출합니다.
• 역전사 반응: 추출한 RNA에 역전사 효소와 역전사 반응에 필요한 프라이머, 뉴클레오타이드 등을 넣어 반응시킵니다. 이 과정에서 cDNA가 합성됩니다.

 

2. 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)

cDNA가 만들어지면, 이를 PCR을 통해 증폭시킵니다. PCR 과정은 크게 세 단계로 나뉩니다:

• 변성(Denaturation): 반응 혼합물을 높은 온도로 가열하여 이중 나선 DNA를 단일 가닥으로 분리합니다.
• 결합(Annealing): 온도를 낮추어 프라이머가 cDNA의 특정 서열에 결합하게 합니다.
• 연장(Extension): 중합효소가 프라이머에 결합된 cDNA 가닥을 따라 새로운 DNA 가닥을 합성합니다.

이 과정을 여러 번 반복하면 원하는 DNA 서열이 지수적으로 증폭됩니다.

 

RT-PCR의 방법 모식도 - 주형으로 mRNA 사용 (출처: 위키피디아, https://en.wikipedia.org/w/index.php?curid=37925789)

 

 

 

 

RT-PCR의 장점과 한계

 

장점:

• 민감도: 아주 소량의 RNA도 검출할 수 있습니다.
• 정확성: 특정 RNA 서열을 정확히 증폭할 수 있습니다.
• 속도: 상대적으로 빠르게 결과를 얻을 수 있습니다.

한계:

• 오염 가능성: 샘플 오염이 발생하면 잘못된 결과를 초래할 수 있습니다.
• 복잡성: 실험 설계와 수행 과정이 다소 복잡할 수 있습니다.

 

 

RT-PCR은 RNA를 DNA로 변환하여 증폭하는 강력한 분자 생물학 기술입니다. 이 방법은 질병 진단, 유전자 발현 분석 등 다양한 응용 분야에서 중요한 도구로 사용되고 있습니다. 이를 통해 연구자들은 RNA 바이러스의 존재를 검출하거나, 유전자 발현을 분석하는 등 여러 과학적 문제를 해결할 수 있습니다.

 

 

 

 

 

참고로, RT-PCR은 수행 목적에 따라 다음과 같이 나누어 볼 수 있습니다.

 

• gene-specific priming: 특정 유전자를 발현시키는 염기서열에 붙는 프라이머 활용
• Oligo(dT) priming: poly(A) tail에 붙는 프라이머 활용
• Random hexamer priming: target RNA의 길이가 너무 길거나, secondary structure가 너무 많아 cDNA가 효과적으로 증폭되지 않는 경우

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

[참고문헌]

- Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 3rd edition